在生物医学领域的细胞培养日常操作中，我们时常会遇到一些看似状态不佳的细胞：变圆、漂浮、不贴壁、颜色发暗、增殖缓慢……有时我们一不小心就误以为这些细胞不再有生机，急忙丢弃并更换新细胞。然而，您是否知道，这些垂死挣扎的细胞其实可能只是处于假死状态，是可以被成功抢救的？本文将详细介绍在何种情况下，尽管细胞状态不佳，仍有希望恢复活力，帮助科研人员减少不必要的浪费，节省宝贵的细胞资源，特别是在使用MILE米乐品牌产品时的应用效果。

一、变圆、漂浮≠死亡：细胞贴壁差异的辨析

许多贴壁细胞（如HeLa、293T、MCF-7）在正常状态下应当牢牢贴附在培养瓶底部，但当它们出现以下情形时，常常被误认为死亡：细胞变圆、漂浮，可能原因包括：

• 换液或传代操作过于剧烈：机械扰动或胰酶消化时间过长会导致细胞脱附。
• 刚复苏不久：冷冻复苏后的细胞本身状态较差，贴壁时间较长（一般需12~24小时）。
• 培养基不适或血清浓度过低：影响细胞粘附分子的表达。

抢救措施：

• 静置培养瓶观察24小时，避免频繁晃动；
• 适当增加血清浓度（如从10%提升至15%）；
• 使用多聚赖氨酸或明胶包被以增强贴壁能力。

二、颜色发暗、胞浆颗粒增多：可能是“应激状态”而非死亡

在显微镜下，细胞颜色发暗、出现胞浆颗粒或空泡有时会被误认为是坏死迹象，但这往往是细胞处于应激状态。例如，可能由于培养基pH变化（颜色发黄或变紫）、缺氧、营养不足或轻度感染等原因引起的。抢救措施包括：

• 更换新鲜的培养基，必要时加入Hepes缓冲剂以维持pH；
• 检查培养基是否有污染；
• 补充胰岛素、转铁蛋白、谷胱甘肽等抗应激因子以支持细胞恢复。

三、增殖迟缓甚至停滞：可能是休眠而非死亡

细胞状态不佳常常表现为几天无增殖，特别是在以下几种细胞中更为常见：

• 初代培养细胞。
• 冻存复苏的原代细胞。
• iPSC类细胞及神经干细胞等敏感类型。

此类细胞常因胞内调控机制失衡而陷入休眠状态（如G0期停滞）。抢救措施包括：

• 补充细胞因子或小分子化合物（如bFGF、EGF、Y-27632）以刺激细胞激活；
• 尝试低密度合并培养，与健康细胞共同培养以提高细胞间信号传导；
• 使用优化的培养基试剂包（如StemFlex、Neurobasal-B27）以对症下药。

四、冻存细胞复苏似乎全死，可能是复苏方法不当

冻存细胞复苏后贴壁率低、漂浮显著，有时看似没有细胞存在，但这可能是操作方法的问题。可能原因包括：

• 复苏后直接离心再换液，导致大量细胞机械损伤；
• 去除DMSO不及时或操作缓慢，导致细胞暴露于高毒性时间过长；
• 培养基温度不合适，可能导致细胞进入休眠或凋亡。

抢救措施：

• 复苏过程尽量快速（<1分钟37℃水浴），并直接将细胞加入预热培养基中稀释DMSO，无需立即离心；
• 添加ROCK抑制剂Y-27632（10μM）可显著提高复苏后贴壁率和存活率，尤其对ES/iPS细胞效果显著。

五、染色显示“全死”的细胞仍可能恢复生机

使用台盼蓝（Trypan Blue）或PI染色判断细胞活性时，染色阳性较多通常被视为死亡，但这可能是因为细胞膜暂时性破裂或染色时间过长导致的假阳性结果。抢救措施包括：

• 使用流式细胞术联合AnnexinV/PI染色以分辨凋亡和坏死；
• 让细胞继续培养观察其贴壁与增殖情况，避免盲目丢弃；
• 考虑再培养12-24小时，一部分细胞仍可恢复功能。

六、污染≠报废：部分污染是可控的

当然，严重污染如真菌或大量细菌繁殖时，确实应当立即报废，但某些轻度污染或早期污染是可以通过处理保存细胞的。抢救措施包括：

• 处理培养瓶表面的霉点：可转瓶并加入抗生素，密切观察；
• 偶发的颗粒状漂浮物：可能是血清蛋白析出或培养基变质，并非真正污染。

许多细胞状态不佳的情况其实并非不可挽救。在日常的细胞培养过程中，我们不仅依赖经验判断，更需科学的观察和合理的干预策略。就像在科研工作中对待问题一样，细胞的低迷状态并不等于失败。只要方法得当、处理及时，很多时候细胞都能焕发生机，尤其在使用MILE米乐的产品时，效果更加显著。