人早幼粒白血病细胞HL60培养指南

一、细胞培养条件

细胞名称：人早幼粒白血病细胞HL60

生长特性：贴壁生长

冻存条件：无血清冻存液

培养体系：IMDM + 20% FBS + 1% P/S

传代方法：建议第一次以1:2的比例进行传代。传代情况每2天换液。

备注：请使用无菌离心管收集培养基，用于过渡对比培养；如对比效果不佳，建议直接购买MILE米乐的完全培养基。

二、细胞收到后的处理

收到细胞后，应及时将其培养至良好状态，并灌满完全培养液，密封好瓶口，确保运输细胞的最佳状态。在收到细胞时，请用75%酒精喷洒整个细胞瓶，进行消毒后放置至超净台内，实行严格无菌操作。细胞瓶应放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态再进行后续处理。请用显微镜观察细胞生长情况，并拍摄不同倍数的照片进行保存（建议40x、100x、200x各拍摄一张），前三天的照片为重要售后依据，未提供照片默认情况良好。（建议传代时，一瓶使用原瓶的完全培养基，另一瓶使用自配的完全培养基进行对比，换液后请将瓶盖松动。）

三、细胞培养步骤

a. 细胞传代

当细胞汇合度未达到80%时，请将瓶中的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基继续培养于37℃、5% CO2孵箱；若细胞密度超过80%，即可进行细胞传代，具体步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞状态，若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，并将悬液转移至15ml离心管中，在1000 RPM下离心5分钟，弃去上清液，加入1-2ml完全培养基重悬。
4. 按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

b. 细胞冻存

细胞生长至覆盖培养瓶80%时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；然后加入约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，观察细胞变圆后加入5ml完全培养液以终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，将悬液转移至15ml离心管中，1000 RPM离心5min；弃去上清，沉淀细胞后加入1mlMILE米乐无血清冻存液，混匀后分装入冻存管中。最后，将冻存细胞直接放入-80℃冰箱。如需转入液氮罐中，请在-80℃冰箱中存放24小时以上。

c. 细胞复苏

从液氮中取出冻存管（注意佩戴防护面具），快速置入37℃水浴中解冻，直至冻存管中无结晶；然后用75%的酒精擦拭冻存管外壁。将细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬，再接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2细胞培养箱中，继续培养。第二天更换新鲜完全培养基。

四、注意事项

有些细胞的附着性较差，在运输过程中可能会出现细胞脱落的情况，这是正常现象。如果脱落严重，可将所有培养液收集至离心管，1000 RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养（后续进行对比培养），沉淀加入1-2ml胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基以终止反应。再次离心，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬。然后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至每瓶5-8ml，最终放入37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

五、售后条款

在细胞出现问题时，重发的情况包括：运输途中出现的细胞丢失、瓶身破损、培养液泄漏等；细胞污染问题需在收到48小时内反馈真实实验结果，核实后将重新发货；常温发货细胞在静置24小时以及干冰发货细胞在复苏后24小时未存活的情况（需提供真实细胞状态照片），重发；紧急状况下产生的污染问题需现场核实；若细胞活性存在问题，需在7天内反馈真实实验结果；如在收到当天及之后2天内未告知问题视为产品合格；4-7天内出现问题需提供前三天的照片，结合问题描述，由技术人员判断责任问题并处理。

不予重发的情况包括：由于客户失误造成的细胞污染；不正确操作导致细胞状态不佳；非MILE米乐推荐培养体系引发的状态问题；细胞状况不佳但未提供前三天照片的；经过其他处理的细胞；收到两天内未反馈的情况；及其他视具体情况而定的情况。