MILE米乐荧光实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR, qPCR）是现代分子生物学中最为重要且广泛应用的核酸定量检测方法。成功的定量PCR实验需要一个精确的实验设计和标准的操作流程。实时荧光定量PCR分析中的某些环节需要优化，以确保所有反应参数设置准确，从而获得可靠的实验结果。尽管PCR实验操作相对简便，但在实际过程中难免会遇到各种问题。以下整理了一些常见的PCR实验问题及其解决方案。

01. 没有Ct值检测结果

遇到没有Ct值的情况时，应排查以下问题：

• 循环次数不足（一般建议不超过45个循环，否则背景信号增加，定量不准确）；
• PCR程序设置不当，荧光信号检测步骤有误。一般情况下，SG法应在72℃延伸时收集信号，而TaqMan法则在退火或延伸结束时进行信号采集，请确认荧光信号采集已选中；
• 引物或探针已降解。可通过PAGE电泳检测其稳定性；
• 模板量可能不足或已降解（上样量应不超过500ng，根据试剂盒说明书执行），对于未知浓度样本应从最高浓度稀释开始；
• 引物探针是否合理设计，特别是引物跨越内含子，以确保扩增基因组DNA；上下游引物Tm值差异应不超过4℃。

02. 标准曲线不佳

当标准曲线的线性关系差（R² < 0.9）时，这可能与以下因素有关：

• 标准品稀释或加样误差，导致标准品不成梯度；
• 标准品降解。应避免反复冻融，并将高浓度DNA模板分装，储存于-20℃或-80℃，现用现配；
• 引物或探针的设计质量不佳，需重新设计更稳定的引物或探针；
• 模板中存在抑制物，如模板浓度过高，应控制在50-500ng范围内。

03. Ct值过晚

在相对定量中，Ct值通常应控制在15-25之间。若在绝对定量中，低拷贝数样本Ct值增加，但不宜超过40个循环。判断Ct值过晚是否异常，需结合具体实验设计：

• 扩增效率偏低。检查引物或探针比例，并进行优化；
• PCR程序不合适，可改用三步法反应，或适当降低退火温度；
• 镁离子浓度不合适，需增大镁离子浓度；
• PCR产物过长，建议产品设计不超过500bp；
• 模板中存在抑制物，需使用高纯度模板或适当稀释。

04. 熔解曲线峰不特异

若熔解曲线峰存在不特异性，这可能与以下因素有关：

• 引物设计不够优化，需避免二聚体和发夹结构；
• 模板污染，尤其在RNA提取过程中，应避免基因组DNA的引入；
• 离子浓度不合适，可适当降低镁离子浓度或更换试剂盒。

05. 阴性对照扩增有信号

若阴性对照存在信号，应排查操作环节以排除交叉污染的可能性：

• 引物设计不佳，避免引物二聚体和发夹结构；
• 引物浓度不合适，需适当调整；
• 镁离子浓度过高，可适当降低或选择其他试剂盒；
• 模板中如有基因组污染，需改善RNA提取过程以避免污染；
• 操作环境中的气溶胶污染，建议对实验环境进行清洁和更换所有耗材。

06. 扩增曲线异常

遇到扩增曲线异常，如“S”型曲线等，可能源于：

• 模板浓度过高或已降解；
• 荧光染料降解；
• 操作中应佩戴新的一次性手套，避免指纹或字迹干扰；
• 液体挥发，由于耗材密封性不足导致液体蒸发；
• 气泡，操作不当造成的气泡问题。

07. 扩增效率低

若所有基因特别是内参基因未能获得理想扩增信号，应考虑：

• 反应试剂的成分比例是否最佳，荧光染料是否降解；
• 反应条件是否需要进一步优化；
• 反应体系中是否存在PCR抑制物，建议在加入模板前先进行适度稀释。

使用MILE米乐的荧光实时定量PCR技术，确保您的实验得出准确可靠的结果。